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ISO 846-1996塑料在真菌和细菌 作用下的行为测定（摘译）
徐凤霞 译、吴立丽 校
ISO（国际标准化组织）是由各国标准化团体（ISO成员）组成的世界性的联合体。国际标准的制定工作通常由ISO技术委员会来进行。
国际标准ISO846是由ISO/TC61技术委员会制定的 ，SC6分委员会主要从事制订塑料的老化和耐化学与环境特性标准的工作。
在一定的气候和环境条件下，微生物能在塑料或塑料制品的表面生长繁殖。它们和（或）它们的代谢产物不仅能破坏塑料本身，也可能影响到建筑材料和包含有塑料部件的系统的使用可靠性。 1. 范围 本标准描述了由于真菌、细菌和土壤微生物的作用导致塑料劣化的测定方法。 劣化的类型和程度可以用下列方法确定。 a）目测 b）质量变化 c）其他物理性质的变化 本实验适用于所有具有平坦表面而容易清洗的塑料制品。多孔材料如泡沫塑料除外。 本国际标准使用与IEC68-2-10中一样的实验真菌及IEC中所谓的“群样法”－即使用孢子悬浮液来接种样品，然后对接种样品培养。该方法除了测定样品的物性破坏外，还对真菌生长进行评定。 2. 引用标准（略）
3. 定义 4. 原理
4.1实验包括在规定的温度和湿度条件下，在规定的或一致认定的时间段内，使实验样品暴露在选定的真菌和细菌等实验菌种作用环境下（或者，在土壤填埋实验中，暴露在细菌性活性土壤中）。 5. 设备及材料 5.1适用于所有实验
5.1.1细菌培养箱 5.1.2干燥箱，能在45℃控温用于干燥实验样品。 5.1.3干燥剂，能保持标准温度和湿度条件（23℃和50%RH）用于实验和控制样品的条件。 5.1.4高压消毒蒸锅，能保持温度和压力分别为120℃，2bar，用于培养皿的灭菌。 5.1.5分析天平，精确到0.1mg。 5.1.6离心过滤机 5.1.7体视显微镜，放大倍数50倍。 5.1.8由玻璃或塑料材质制造的易处理的培养皿，该培养皿具有合适的尺寸,用于样品的暴露实验。 5.1.9玻璃容器，体积约1升（高16cm，直径11cm），如带盖子的保鲜瓶。
5.1.10蒸馏水或去离子水 5.1.11杀菌液 5.1.11.1乙醇—水混合物，重量比70:30 5.1.11.2邻苯基苯酚 50ml90%乙醇中溶解1g邻苯基苯酚，用水配至1000ml，滴加乳酸PH值调至3.5，使用的杀菌液应在实验报告中注明。 5.2真菌实验 5.2.1实验真菌 实验真菌应从国家培植物标本中获得，使用的菌种在表1中列出，在实验报告中注明。 表 1
如果由于技术原因， 经对此感兴趣的成员团体协商后，可使用其它种类的菌种，这种情况下也应该在实验报告中注明所用菌种。 在用作电子元件和电子设备的塑料上进行实验时，使用IEC68-2-10描述的方法，使用表1中的Aspergillus niger，Penicillium funiculosum，Paecilomyces variotii和Gliocladium virens菌种和表2中的四种菌种。 表 2
5.2.2标准菌种 在试管里于琼脂斜面上对实验真菌（5.2.1）进行培养，琼脂成分如下: 麦片粥 20g 麦芽浸膏 10g 琼脂 20g 水 1000ml 在高压消毒蒸锅中于饱和蒸汽压下在120℃±1℃条件下灭菌20分钟。在29℃±1℃或24℃±1℃温度下进行细菌培养之后，形成可供使用芽孢。在上述温度下此芽孢的储存不应超过4周。 ????人造培养基上，由于实验真菌在培养过程中有发生遗传学和生理学变化的可能性，因此两代培养的时间间隔须通过适当的方式（如培养物的冷冻脱水，在+4℃或液氮中储存）缩短到最小。 5.2.3溶液和培养基 5.2.3.1标准无机盐溶液，成分如下（仅能使用分析纯或相当纯度的化学药品）: NaNO3 2.0g KH2PO4 0.7g K2HPO4 0.3g KCl 0.5g MgSO4.7H2O 0.5g FeSO4.7H2O 0.01g H2O 1000ml 用0.01mol/l无菌NaOH溶液调节PH值至6.0～6.5。 5.2.3.2无机盐/润湿剂溶液，把0.1g无毒的润湿剂如N-甲基牛黄酸或聚乙二醇醚加到1L标准无机盐溶液（5.2.3.1）中，在高压消毒蒸锅中于120℃±1℃的温度下灭菌20分钟。 5.2.3.3无机盐/葡萄糖溶液，把足量的葡萄糖溶液加到标准的无机盐溶液（5.2.3.1）中，得到浓度为30g/l±1g/l溶液，在高压消毒蒸锅中于115℃±1℃的温度下灭菌30分钟。 5.2.3.4非完全琼脂培养基，把足量的琼脂加到标准的无机盐溶液（5.2.3.1）中，得到浓度20g/l溶液，边煮边搅拌溶液以使琼脂溶解，在高压消毒蒸锅中于120℃±1℃的温度下灭菌20分钟。灭菌之后，用0.01mol/l无菌NaOH溶液调节PH值至6.0～6.5。 5.2.3.5完全琼脂培养基，把足量的葡萄糖溶液加到非完全琼脂培养基中，得到浓度30g/l±1g/l溶液，在高压消毒蒸锅中于115℃±1℃的温度下灭菌30分钟。灭菌之后，在20℃用0.01mol/l无菌NaOH溶液调节PH值至6.0～6.5。 6. 实验试样
6.1形状和尺寸样品的形状和尺寸由将做的实验所决定。
6.2样品组及每组数量 6.2.1样品组 对每个试样和每种实验方法，准备三组样品 I组:用微生物接种并已培养的样品; S组:灭菌样品，在与I组相同的条件下保存。 6.2.2每组的数量 目测时，每组至少制备5个样品，即每个试样和每种实验方法总计至少15个样品。 测量质量变化时，每组至少制备6个样品， 即每个试样和每种实验方法总计至少18个样品。 7. 样品制备 7.1清洗 在方法A中，把样品浸到乙醇—水混合物（5.1.11.1）中1分钟并在45℃干燥4小时，除非乙醇对它们有不利影响，如果真有影响，将样品贮存在无菌的容器中，用无菌镊子夹取样品，以后的实验都要用镊子夹取样品以避免外部的有机物质污染样品。 7.2标注和保存 在环境温度下，将清洗过并已标注过的（或加印记）样品保存在培养皿中（5.1.8）。并在培养皿上而不是样品上进行标注，以避免样品表面发生反应。 7.3调整和称量 把用于测定质量变化的样品组在环境温度下保存在干燥器（5.1.3）中，直至每个样品的质量（m1，m2，m3，等等）恒定到接近0.1mg（通常在48小时之后），记录每一样品的质量。如无其它要求，用于目测和（或）用于测量物理性质（除质量变化外）变化的样品不需调整这个阶段。 8. 实验步骤 8.1实验温度 在23℃±1℃和（50±3）%RH的标准条件下（见ISO 291）制备和评价样品，并在24℃±1℃或29℃±1℃进行培育。 8.2.真菌生长试验（方法A） 8.2.1.装填培养皿 灭菌之后，把非完全琼脂培养基（5.2.3.4）倒入灭菌的培养皿中，深约5mm，然后冷却固化。 8.2..2实验样品放置 尽可能平展地把样品分别放在固化了的培养基上，避免样品之间或样品与培养皿壁之间任何接触。随意地把制备好的培养皿分成数量相同的两组，一组标I，另一组标S。 假如预料样品会从培养基中浮起，用重物稳定住它们。 8.2..3孢子悬浮液的制备 利用无机盐/润湿剂溶液（5.2.3.2），由好的芽孢制备孢子悬浮液。 8.2.3.1孢子采集 每一培养管中（见5.2.2）放入5ml无机盐/润湿剂溶液，用一无菌的接种针慢慢地刮芽孢表面，以制备液态的孢子悬浮液。慢慢地振动培养管以分散液体中的孢子，用相同的培养试管重复此过程三次，然后用无菌玻璃球振动每一真菌培养管的孢子悬浮液，通过一薄层无菌棉或玻璃棉过滤以除去真菌生成物。 8.2.3.2离心洗涤孢子与工作液制备 将过滤后的孢子悬浮液进行无菌离心处理，去掉上清液，再使沉淀物在25ml无机盐溶液（5.2.3.1）中悬浮，再离心。使洗涤过的沉淀物在50ml标准无机盐溶液中悬浮，反复对孢子悬浮液进行洗涤是为了保证消除可能引起塑料应力开裂的所有表面活性物质。 调节浓度至约106个孢子/ml（使用计数器或浊度仪来确定）。 对每一实验真菌都重复上述操作，混合含有相同孢子数量的相同体积的五种悬浮液，以得到最终的混合孢子悬浮液用来培养。制备后的孢子悬浮液应在6小时内使用。 注—当试验新的塑料配方时，研究人员可使用单一真菌或已选择好的几种真菌组成的混合物来进行预实验。 8.2.4孢子寿命检验 将完全琼脂培养基（5.2.3.5）注入到两个无菌培养皿中，按8.2.1.所示步骤，从每一种孢子悬浮液（混合之前）取一滴进行接种。在24℃±1℃或29℃±1℃培育3～4天（在与实际相同温度条件下进行寿命检验），如真菌没有大量生长，用其它的培养管来制备新的孢子悬浮液并重复此实验。 8.2.5样品的接种或消毒 对I组中的样品，吸取0.1ml在8.2.1.3中制备的孢子悬浮液均匀的喷在每一样品和琼脂培养基的表面;对S组中的样品，吸取3ml杀菌液（5.1.11）喷在每一样品和琼脂培养基的表面。 8.2.6培养 在24℃±1℃或29℃±1℃培育已接种的样品和无菌对照样品4周或更长时间。采取保护措施防止冷凝水滴在样品表面。假如实验周期长于4周，根据8.2..5每4周样品要用在无菌水中洗涤和离心过的孢子悬浮液（见8.2..3.2） 再接种一次。 假如用目测，在4周的培育期内，如果用肉眼即可以看到真菌的生长，则实验可以结束。 假如目测结果不明显，可以延长实验期。如果将样品移植到新制备的琼脂培养基上并每隔4周接种一次，那麽所得的实验结果将比仅仅对样品进行重复接种而不进行移植的方法要好。 9. 评定 9.1目测来评定样品上真菌的生长 首先用目测观察暴露的样品（L组和S组），假如必要，有时可用体视显微镜观测（放大倍数为50倍）。按照表3中给出的等级数评定真菌的生长程度。方法A中，也给出了样品周围培养基上真菌生长的强度。 注—为了提高评定的准确度，建议把一网格放在样品上以便能评定表面上真菌比表面生长。 假如在一组中样品的目测结果差别大于两个等级级别，那麽要用新的样品重新测定。 表３ 真菌生长行为的评定
9.2用于确定实验样品在质量和（或）其它物理性质方面变化的测量方法。 9.2.1清洗 从琼脂中拿出实验样品，把它们浸泡到乙醇—水混合物中（5.1.11.1）5分钟后，在流水下漂洗，然后用滤纸擦净，最后在室温下隔夜干燥。 在测定的最后，使用气体（如环氧乙烷）或蒸汽（在高压消毒蒸锅里）给目测到有细菌生长的瓶子灭菌。 9.2.2质量变化 为了测定质量变化，把清洁的样品放在干燥器中，定期称量它们的质量，（精确到0.1mg），直至恒重（通常在48小时内）。记录最终质量m1’、m2’………。 注—建议可按照7.3中描述的方法进行。 对于每一个样品，测定暴露前后的质量差值，即（m，如（m1=m1’－m1，这个差值通常是负数，相当于质量有损失。 当测量质量变化时，接种的样品和无菌的对照样品应有相同的尺寸。 9.2.3其它物理性质变化的测定 测量暴露样品和未暴露的对照样品的性质，如果可能，应同时进行。根据各自的原料，产品或标准实验方法进行选择，如下:从有关的塑料成型材料标准中选择测定参数，样品调节，实验条件和样品尺寸。 假如必要，对此感兴趣的成员经协商后可改变实验条件，在实验报告中应注明此条件。 10. 结果表示 利用各种结果，计算数学平均值和标准偏差。 10.1目测 每一样品的目测结果可采用表3中给出的真菌生长级数的方式来表达 。 结果的解释如表4所示。
表4 结果解释
10.2质量变化 测定每一样品的质量变化（m=m’－m， ，计算并记录每一组的数学平均值Mi、△Ml和△Ms 精确到到小数点后第一位，质量变化的平均百分率采用下述公式计算 （△Ml－△Ms）/?Mi ×100 …⑴ 式中: Mi是原始样品质量的平均值。 利用统计分析的方法测定样品的质量是否有显著的变化（可信度99%） 公式（1）仅仅应用在具有相同尺寸的L组和S组的样品，所以在暴露之前质量有可比性。 10.3其它物理性质的参数 计算每组样品（O，L和S组）在每一性质变化的数学平均值，分别记Vo、Vi、Vs 。 对每一性质，用公式（2）计算接种样品相对于灭菌样品的变化百分率 =Vi / Vs × 100 … ⑵ 对每一性质，用公式（3）计算接种样品相对于对照样品的百分率变化 =Vi/ Vo× 100…⑶ 第一个值比第二个值能更好地表征生物对塑料的破坏作用。 |
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